Rosetta 2(DE3)感受態(tài)細胞

產(chǎn)品規格CAT#: BFNC86077-01(10×100ul)/BFNC86077-02(50×100ul)

Rosetta 2(DE3)：                                               100μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                           10μl

保存條件(保質(zhì)期)：                                   -80℃（6個(gè)月）

基因型

F^- ompT hsdS_B(r_B^- m_B^-) gal dcm (DE3) pRARE2 (Cam^R)

產(chǎn)品說(shuō)明

Rosetta 2(DE3)菌株來(lái)源于BL21，是BL21的衍生菌株，為L(cháng)on蛋白酶和膜外蛋白酶OMPT的缺陷型菌株，這兩種酶的缺失有效防止異源蛋白在大腸桿菌體內的降解。將具有氯霉素抗性的pRARE2質(zhì)粒導入BL21 (DE3)細胞中即是Rosetta 2(DE3)，pRARE2質(zhì)?？裳a充大腸桿菌缺乏的7種稀有密碼子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA和CGG)對應的tRNA，提高外源基因的表達水平。該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區 (DE3區含有T7噬菌體RNA聚合酶)，可同時(shí)表達T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達。

青旗生物生產(chǎn)的Rosetta 2(DE3)感受態(tài)細胞由特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測轉化效率達10⁸ cfu/μg DNA。

操作方法

1. Rosetta 2(DE3)感受態(tài)細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的質(zhì)粒并用手bo打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰中并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì )降低轉化效率。

3. 向離心管中加入700 μl不含抗生素的LB無(wú)菌培養液，37℃，200 rpm復蘇60分鐘。

4. 5000 rpm離心一分鐘收菌，留取50 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應抗生素的LB培養基上。

5. 將平板倒置放于37℃培養箱過(guò)夜培養。

Rosetta 2(DE3)感受態(tài)細胞

IPTG配制：

    Prepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)

    by dissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use.

氯霉素配制

Chloramphenicol  34 mg/ml in ethanol. Store at -20℃. Use at 34 µg/ml.

注意事項

1. 感受態(tài)細胞盡量在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內加入目標DNA，不可在冰中放置時(shí)間過(guò)長(cháng)，長(cháng)時(shí)間存放會(huì )降低轉化效率。

2. 轉化高濃度的質(zhì)?？上鄳獪p少終用于涂板的菌量。

3. 誘導時(shí)，IPTG濃度可選（0.1-10 mM均可）。

4. 為獲得需要量的蛋白，誘導時(shí)間，溫度，IPTG濃度需實(shí)驗者優(yōu)化。

5. Rosetta 2(DE3) 菌株攜帶 pRARE2質(zhì)粒，除復蘇培養基為無(wú)抗生素外，其余所用培養基、培養液均應含有34 µg/ml氯霉素，以防質(zhì)粒丟失。