R5421感受態(tài)細胞

產(chǎn)品規格CAT#: BFNC86064-01(10×100ul)/BFNC86064-02(50×100ul)

R5421 Competent Cell:                                       100μl/支               保存： -80℃（3個(gè)月）

pGADT7 (control vector, 10 ng/μl)                           10μl               保存：-80℃（12個(gè)月）

Carrier DNA (10 μg/μl)                                             100μl              保存：-20℃（12個(gè)月）

PEG/LiAC:                                                                    5ml              保存：    4℃（12個(gè)月）

基因型

MATα ura3-52 leu2 trk1Δ his3Δ200 his4-15 trk2Δ1::pCK64

產(chǎn)品說(shuō)明

R5421釀酒酵母菌株為K⁺/鉀離子缺陷型菌株，在文獻中也稱(chēng)為CY162，MATα型，多用于K⁺/鉀離子轉運蛋白的鑒定試驗中，也可用于K⁺/鉀離子通道或鈉鉀離子泵的鑒定試驗。Transformation marker為：ura3，leu2，該菌株可以在含有100mM KCl的培養基中國正常生長(cháng)，在含有5-10mM KCl的培養基中生長(cháng)緩慢，當培養基中KCl濃度低于0.5mM，R5421（CY162）細胞停止生長(cháng)。

青旗生物生產(chǎn)的R5421感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保存三個(gè)月，pGADT7質(zhì)粒檢測轉化效率>10³ cfu/μg DNA。

操作方法

1. Carrier DNA 在每次使用前要通過(guò)加熱處理使其變性為單鏈狀態(tài)，步驟如下：Carrier DNA 放95℃水浴或金屬浴3 min，快速插入冰中，靜置3 min，再次放95℃水浴或金屬浴3 min，快速插入冰中，靜置3 min以上。

2. 取100 µl冰上融化的R5421感受態(tài)細胞，依次加入預冷的目的質(zhì)粒0.5-3 µg，Carrier DNA10 µl，PEG/LiAc 500 µl并吸打幾次混勻，30℃水浴30 min (15 min時(shí)翻轉6-8次混勻)。

3. 將管放42℃水浴15 min (7.5 min時(shí)翻轉6-8次混勻)。

4. 5000 rpm離心 40 s棄上清，ddH₂O 400 µl 重懸，離心 30s棄上清。

5. ddH₂O 50 µl重懸，涂板，29℃培養48-96 h。

R5421感受態(tài)細胞

注意事項

1. 感受態(tài)細胞盡量在冰上融化。

2. 轉化高濃度的質(zhì)?？上鄳獪p少終用于涂板的菌量。

3. 同時(shí)轉化2-3種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量。

4. R5421酵母菌株對高溫敏感，適生長(cháng)溫度為27-30℃；高于31℃，生長(cháng)速度和轉化效率呈指數下降。

5. 菌落變粉不是污染，是酵母細胞生長(cháng)中一個(gè)常見(jiàn)現象。當細胞在平板培養幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母試圖通過(guò)自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。

6. 酵母在缺陷培養基中生長(cháng)速度比YPDA培養基慢，培養基中缺陷成分越多，生長(cháng)越慢，以轉化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48 h培養可見(jiàn)直徑1 mm克??；涂SD單缺平板29℃，48-60 h培養可見(jiàn)直徑1 mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80 h培養可見(jiàn)直徑1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養可見(jiàn)直徑1 mm克隆。