Rosetta-gami B(DE3)感受態(tài)細胞

產(chǎn)品規格CAT#: BFNC86075-01(10×100ul)/BFNC86075-02(50×100ul)

Rosetta-gami B(DE3)：                             100μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                    10μl

保存條件(保質(zhì)期)：                             -80℃（6個(gè)月）

基因型

F^- ompT hsdSB(r_B^-m_B^-) gal dcm lacY1 ahpC (DE3) gor522::Tn10 trxB pRARE (Cam^R, Kan^R, Tet^R)

產(chǎn)品說(shuō)明

Rosetta-gami B(DE3) 菌株聚合了BL21，Tuner，Origami和 Rosetta四種菌株的優(yōu)點(diǎn)：

＊ lacY1基因 (半乳糖苷透性酶基因)突變賦予其Tuner菌株的優(yōu)點(diǎn)——IPTG以均一速度進(jìn)入體系中大腸桿菌的每個(gè)細胞，產(chǎn)生更加嚴格、均一的濃度依賴(lài)。

＊ pRARE賦予其Rosetta菌株的優(yōu)點(diǎn)——補充大腸桿菌缺乏的6 種稀有密碼子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)對應的tRNA，提高外源基因的表達水平。

＊ gor522::Tn10 trxB賦予其Origami菌株的優(yōu)點(diǎn)——突變的硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase) (trxB)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase) (gor)基因，它們是還原途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶，其突變有利于高效形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白，增強蛋白的可溶性。

＊ 該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區 (DE3區含有T7噬菌體RNA聚合酶)適合T7啟動(dòng)子誘導的蛋白表達。

＊ Rosetta-gamiB(DE3)菌株具有卡那霉素，氯霉素，四環(huán)素抗性，由特殊工藝制作，經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測轉化效率高達10⁸ cfu/μg DNA。

操作方法

1. Rosetta-gamiB(DE3)菌株感受態(tài)細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA并用手bo打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì )降低轉化效率。

3. 向離心管中加入700μl不含抗生素的無(wú)菌培養基 (2YT或LB)，混勻后37℃，200rpm復蘇60分鐘。

4. 5000rpm離心一分鐘收菌，，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含34 µg/ml氯霉素及所選質(zhì)粒篩選抗生素的2YT 或LB培養基上。

5. 將平板倒置放于37℃培養箱過(guò)夜培養。

Rosetta-gami B(DE3)感受態(tài)細胞

IPTG

Prepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) by

dissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use.

注意事項

1. 感受態(tài)細胞盡量在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內加入目標DNA，不可在冰中放置時(shí)間過(guò)長(cháng)，長(cháng)時(shí)間存放會(huì )降低轉化效率。

2. 混入質(zhì)粒時(shí)應輕柔操作。

3. 轉化高濃度的質(zhì)?？上鄳獪p少終用于涂板的菌量。

4. 誘導時(shí)，IPTG濃度可選(0.1-2mM均可)。

5. 為獲得需要量的蛋白，誘導時(shí)間，溫度，IPTG濃度需實(shí)驗者優(yōu)化。

6. 具有卡那霉素抗性，不能用于具有卡那霉素抗性質(zhì)粒的表達。